一.培養(yǎng)細胞生長過程：潛伏期→指數(shù)增生期→停滯期
1.1 潛伏期(latent phase)
   細胞接種后,先經(jīng)過一個在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期.此時,細胞質回縮, 胞體呈圓球形.然后細胞貼附于載體表面,稱貼壁,懸浮期結束. 細胞貼壁速度與細胞種類, 培養(yǎng)基成分,載體的理化性質等密切相關。一般情況下，原代培養(yǎng)細胞貼壁速度慢,可達10-24 小時或更多, 而傳代細胞系貼壁速度快, 通常10-30 分鐘即可貼壁。細胞貼壁后還需經(jīng)過一個潛伏階段，才進入生長和增殖期.原代培養(yǎng)細胞潛伏期長，約24-96 小時或更長, 連續(xù)細胞系和腫瘤細胞潛伏期短，僅需6-24 小時。
1.2 指數(shù)增生期(logarithmic growth phase)
   這是細胞增殖**旺盛的階段，分裂相細胞增多。指數(shù)增生期細胞分裂相數(shù)量可作為判定細胞生長是否旺盛的一個重要標志。通常以細胞分裂相指數(shù)（Mitotic index, MI）表示，即細胞群中每1000 個細胞中的分裂相數(shù)。一般細胞的分裂指數(shù)介于0.1%-0.5%，原代細胞分裂指數(shù)較低，而連續(xù)細胞和腫瘤細胞分裂相指數(shù)可高達3％－5％。指數(shù)增生期的細胞活力**好時期，是進行各種實驗**佳時期，也是凍存細胞的**好時機。在接種細胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3－5 天后，隨著細胞數(shù)量不斷增多、生長空間減少，**后細胞相互接觸匯合成片。正常細胞相互接觸后能抑制細胞運動，這種現(xiàn)象稱接觸抑制現(xiàn)象(contact inhibition)。而惡性腫瘤細胞無接觸抑制現(xiàn)象，能繼續(xù)移動和增殖，導致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積（piled up）。細胞接觸匯合成片后，雖然發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍能進行增殖分裂，因此細胞數(shù)仍然在增多。但是，當細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產物增多時，細胞因營養(yǎng)枯竭和代謝產物的影響，導致細胞分裂停止，這種現(xiàn)象稱密度抑制現(xiàn)象（Density Inhibition）。
1.3 停滯期(Stagnate phase)
   細胞數(shù)量達到飽和密度后，如不及時進行傳代，細胞就會停止增殖，進入停止期。此時細胞數(shù)持平，故也稱平臺期（Plateau phase）。停滯期細胞雖不增殖，但仍有代謝活動。如不進行分離傳代，細胞會因培養(yǎng)液中營養(yǎng)耗盡、代謝產物積聚、pH 下降等因素中毒，出現(xiàn)形態(tài)改變，貼壁細胞會脫落，嚴重的會發(fā)生死亡。
為了維持細胞的存活和生長，必須進行再培養(yǎng)，即將原培養(yǎng)瓶內細胞分離、稀釋、接種到新培養(yǎng)瓶內繼續(xù)擴大培養(yǎng)。
二.細胞傳代方法
  根據(jù)細胞生長特點，傳代方法有3種
2.1懸浮生長細胞傳代
多采用離心法傳代。1000轉/分,20-30秒后去上清。沉淀細胞加新培養(yǎng)液后再混勻傳代。亦有直接傳代法，即懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養(yǎng)液去除1/2-1/3，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。本實驗采用此法。
2.2半懸浮生長細胞傳代
此類細胞部分呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使細胞從瓶壁上脫落下來，進行傳代。直接吹打對此類細胞有損傷，亦可采用酶消化法傳代。
2.3貼壁生長細胞傳代
 必須采用酶消化法。常用的消化液有0.05%~0.25%的胰蛋白酶液，0.1%的胰蛋白酶和0.02%的EDTA（1:2~1:4）的混合消化液，等等
三.培養(yǎng)細胞常規(guī)檢查
細胞接種或傳代后，要定時對細胞做常規(guī)檢查，如觀察培養(yǎng)液pH（顏色變化）、清亮度（是否污染）和細胞生長狀態(tài)等，隨時掌握細胞動態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)異常情況及時對癥處理。
1. 營養(yǎng)液pH值：新鮮的RPMI-1640培養(yǎng)液呈橙紅色（pH7.2左右），適合多數(shù)細胞生長。細胞生長旺盛、代謝產生酸性物質積累增多，營養(yǎng)液酸化變黃，pH值下降；若培養(yǎng)瓶瓶塞刷洗不潔，殘留堿性物質，致營養(yǎng)液pH值升高，顏色變紫紅色。兩種變化均對細胞生長不利。采用5%CO2與95%空氣混合氣體，37℃條件培養(yǎng)細胞，可使培養(yǎng)液pH值在一定時間內保持在pH7.2左右。更換營養(yǎng)液的時間可依靠營養(yǎng)物消耗而定，一般情況下，每周換液兩次，每次換半量或1/3量。
2.微生物污染及排除
  污染包括微生物污染、細菌污染、霉菌污染、支原體污染、病毒污染（參閱有關參考書）
  其排除，良好的無菌操作技術是控制污染的基礎。污染時shou先找出污染原因。針對不同原因有相應的處理方法（在此不詳述）。但目前任何處理的方法均對細胞有損傷，所以還應著重污染的預防。
  3.細胞交叉污染及排除
   由于在細胞培養(yǎng)操作過程中，多種細胞培養(yǎng)同時進行時，器材和培養(yǎng)用液混雜易導致細胞交叉污染。這種污染是細胞形態(tài)和生物學特性發(fā)生變化，某些變化不易察覺。導致細胞不純。
 防止交叉污染的措施主要有：器材做好專門標記，培養(yǎng)液公用時，吸管使用分開！
   4.化學物質污染及排除
   主要為殘存洗滌劑、細胞殘余、解體的微生物等。鼓細胞實驗所用全部實驗器材都要嚴格清洗。
   5.健康細胞與衰老細胞
    光鏡下生長狀態(tài)良好的細胞均質、明亮、透明度大、折光性強，相差顯微鏡下可以看清細胞的形態(tài)結構，細胞質中有粗大的線粒體顆粒和核。在細胞衰老，機能不良時，細胞質中常出現(xiàn)黑色顆粒、空泡或脂滴，細胞間空隙加大，細胞形態(tài)變得不規(guī)則或失去原有特性。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
四.培養(yǎng)細胞的生物學檢查和鑒定
一旦培養(yǎng)的細胞生長成為形態(tài)上單一的細胞群和細胞系（株）后，無論是使用它進行研究工作，還是做建系（株）工作，都需要全面了解這些細胞的生物學特性。檢查項目一般有以下內容：
 4.1細胞形態(tài)描述
用相差顯微鏡觀察活細胞并攝影，主要觀察細胞形態(tài)、大小、核漿比例、染色質和核仁大小及多少等。采用蓋玻片條培養(yǎng)計數(shù)和Giemsa染色法，能簡便快速地獲得細胞光鏡圖像特征與電技術結合，可獲得細胞亞顯微結構圖像
 4.2細胞定性
  用于培養(yǎng)細胞的免疫標志的定性方法有兩種：
  （1）免疫組化法 （2）透射電鏡法
4.3  細胞生長曲線
對數(shù)生長期細胞，采用常規(guī)消化傳代方法，制成細胞懸液。一般接種7~8組，每組三瓶（亦可用孔板）。每天檢查一組，每瓶計數(shù)4次，取平均值，再累計三瓶均值，連續(xù)計數(shù)7~10天。**后用坐標紙匯出逐日細胞數(shù)，即得細胞生長曲線。細胞數(shù)量增加一倍的時間即細胞倍增時間。
4.4細胞分裂指數(shù)MI
細胞分裂指數(shù)是指1000個細胞中細胞分裂相的數(shù)目。用以表示細胞增殖的旺盛程度。具體操作請參閱有關資料
   還有細胞標記指數(shù)、細胞DNA定量、細胞周期等
 
 
五.相關的實驗技術：
 5.1 細胞計數(shù)：
（1）計數(shù)板原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數(shù)目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數(shù)目。
（2）操作步驟：每小組一塊計數(shù)板，及蓋玻片
① 將計數(shù)板及蓋玻片用酒精棉球擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板，放在鏡下觀察。
② 制備細胞懸液：將細胞從培養(yǎng)板孔或培養(yǎng)瓶中轉移到離心管，離心1000轉4-5分鐘，棄去上清，加入PBS**一定體積（1ML）。
③ 將細胞懸液吸出少許（10ul）（可將需計數(shù)之細胞懸液先吸取0.5ml左右放在1.5mlEp管中，再拿離超凈臺計數(shù)），滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間，靜置3min，注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。
④計算板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。
 
 ⑤公式計算：
細胞數(shù)/mL=四大格細胞總數(shù)/4×10⁴
說明：公式中除以4，因為計數(shù)了4個大格的細胞數(shù)。
公式中乘以10⁴因為計數(shù)板中每一個大格的體積為：
1.0mm（長）×1.0mm（寬）×0.1mm（高）=0.1mm³ 而 1ml=1000mm³
 ⑥注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團10%以上，說明分散不好，需重新稀釋制備細胞懸液
5.2臺盼蘭染色操作步驟：   
 ① 制備細胞懸液，放入EP管中。
 ② 以1：1的體積比例在上EP管中加入0.4%臺盼蘭染液，染色2_~3分鐘。
 ③ 吸取少許（一滴即可）懸液涂于載玻片上，加上蓋片。
 ④ 鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計算細胞活力。
           根據(jù)實驗需要請參閱相關方法
     懸浮細胞傳代及細胞計數(shù)
一、 細胞傳代
（一）實驗用品：
1．儀器
　   凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、
倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱；
2．器皿
　 培養(yǎng)板（6孔，96孔）、培養(yǎng)瓶、玻璃長吸管（彎頭、直頭）、載玻片、
　 槍頭tip、移液管、長滴管膠塞、15ml離心管、離心管架、廢液缸、
3．其他物品
　 微量加樣器、細胞計數(shù)板、蓋玻片、記號筆、
4．試劑
1640培養(yǎng)液、PBS等
（二）實驗目的：
掌握細胞計數(shù)及懸浮細胞傳代技術。
（三）實驗原理：見前述
（四）本實驗操作步驟：
1.準備：所有實驗操作均在無菌環(huán)境下進行，需提前30分鐘消毒環(huán)境
每小組8-9人用一操作臺。備96孔板一塊，15ml離心管數(shù)支，小平皿1塊，1.5ml Ep管一盒，長玻璃滴管，加樣器及tip等
打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋（管蓋倒放于臺上）。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入1.5mlEp管（放于塑料試管架上）備用。
2.從培養(yǎng)箱內取出培養(yǎng)之K562細胞，每組一瓶。放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。
      生長狀態(tài)檢測：臺盼藍法
      取一滴滴于載玻片上，用臺盼藍染色（見方法），蓋上蓋玻片，鏡下觀察
3.觀察培養(yǎng)瓶孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出瓶中的細胞連同培養(yǎng)液，轉入15ml塑料離心管中。再用另一支吸管吸取PBS量約2ml，加入培養(yǎng)瓶中，輕輕吹打瓶壁，吸出轉入離心管中，大約總量為10ml左右。
4.離心，設置離心機1000轉/分，1-2分鐘，沉淀即可。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
5.取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細胞，使之均勻懸浮后轉**小平皿中待分裝，注意不要污染！
6.吸取0.5―1ML細胞懸液轉入EP管中，備計數(shù)用（10ul加計數(shù)板）。
7.細胞生長曲線觀察及細胞凍存
① 細胞生長曲線觀察
    96孔板一塊，細胞懸液分別放入96孔板孔中，每孔200ul。
  本實驗觀察四天。見96孔板的一側標記1,2,3,（代表第二、三、四天），按順序每排加6孔（即**有6孔），加三排。（注意未加懸液的空白孔要保證未污染，留作復蘇細胞培養(yǎng)用）（具體觀察方法見后）
② 細胞凍存
剩余細胞轉入凍存管中，每組一管，具體方法見凍存操作。
8.鏡下觀察細胞是否分布均勻，放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)。
 
 
 二、細胞計數(shù)及生長曲線測定
（一）實驗目的：
  1.能獨立的進行細胞培養(yǎng)技術操作，繪制生長曲線，了解細胞生長的發(fā)育特性。
  2.學習在科研中如何應用生長曲線
（二）實驗原理：
  生長曲線的測定（計數(shù)法）是測定細胞**生長數(shù)的常用方法，也是判定細胞活力的重要指標，為培養(yǎng)細胞生物學特性的基本參數(shù)之一。一般細胞傳代之后，經(jīng)過長短不同的潛伏期，即進入大量分裂的指數(shù)生長期。在細胞達到飽和密度后，停止生長，進入平頂期，然后退化衰亡。
  為了準確描述整個過程中的細胞數(shù)目的動態(tài)變化，需連續(xù)對細胞進行計數(shù)，通常計數(shù)7天。為精確起見，一般每次計數(shù)三平行樣品（孔或瓶）細胞并取平均值。典型的生長曲線可分為生長緩慢的潛伏期，成平臺狀的平頂期及退化衰亡四個部分。以存活細胞數(shù)對培養(yǎng)時間做圖，即生長曲線。
  生長曲線常用于測定藥物等外來因素對細胞生長的影響。一般在對數(shù)期的1/3-1/2處加藥。細胞技術的時間和次數(shù)依實驗目的而定。
  另外，測定生長曲線的常用方法還有MTT法。
（三）實驗操作
細胞生長曲線繪制
①  每一小組（8-9人）   1 塊 96孔板
   ② 細胞懸液分孔前細胞計數(shù)數(shù)據(jù)，為**天細胞數(shù)數(shù)據(jù)
③ 傳代操作中已做。
96孔板一塊，細胞懸液分別放入96孔板孔中，每孔200ul。
  本實驗觀察四天。見96孔板的一側標記1,2,3, ,（代表第二、三、四天），按順序每排加6孔（即**有6孔），加三排。（注意未加懸液的空白孔要保證未污染，留作復蘇細胞培養(yǎng)用）
④第二天  分別吸取培養(yǎng)板中 **排中 4孔 分別計數(shù)，再將4孔細胞數(shù)平均。
記錄下數(shù)值，即為第二天細胞生長情況。
⑤第三天  重復昨天工作
⑥第四天 同 ④
 ⑦ 繪圖，了解細胞生長情況，估計細胞倍增時間
 
 
。三、哺乳動物細胞凍存與復蘇
（一）實驗目的：
（1）保存種子細胞，以便隨時取用。這是保存細胞的**主要目的。
（2）減少細胞被微生物污染的危險性。
（3）減少細胞之間交叉污染的危險性。
（4）減少細胞因傳代培養(yǎng)而引起的遺傳變異和形態(tài)改變。
（5）避免有限細胞系出現(xiàn)衰老或惡性轉化。
（二）實驗用品：
  1.儀器
　　凈化工作臺、離心機、恒溫水浴箱、冰箱（4℃、-20℃、-70℃）、倒置相差顯微鏡、培養(yǎng)箱、液氮冰箱。
  2.器皿
　　吸管（彎頭、直頭）、培養(yǎng)瓶、玻璃瓶（250ml、100ml）、廢液缸；
　　吸頭、槍頭、膠塞、移液管（10ml）、15ml離心管、凍存管（1～2ml）
  3.其他物品
　 微量加樣槍、紅血球計數(shù)板、記號筆、移液槍。
  4.試劑
 　 培養(yǎng)液、DMSO（分析純）
  K562細胞，慢性粒細胞白血病細胞系中的一種。
（三）實驗原理：
   細胞凍存及復蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以**大限度的保存細胞活力。目前細胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護劑，這兩種物質能提高細胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細胞內的水分滲出細胞外，減少細胞內冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。復蘇細胞應采用快速融化的方法，這樣可以保證細胞外結晶在很短的時間內即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細胞內形成胞內再結晶對細胞造成損傷。
 
 
（四）操作步驟：所有操作均為無菌環(huán)境中，操作臺需提前三十分鐘常規(guī)消毒
1.哺乳動物細胞凍存
1.1.準備：打開培養(yǎng)液，PBS；取出離心管，擰開管蓋，管蓋倒放。從吸管筒中依次取出吸管，裝上吸頭，插入離心管備用。
1.2.配制凍存液：吸取9 ML培養(yǎng)液放入離心管，用移液槍吸取1ML DMSO溶液，逐滴緩慢加入離心管中。**好把離心管插在冰中。
1.3.從培養(yǎng)箱內取出細胞，放在顯微鏡下觀察其生長狀態(tài)、密度。
1.4.觀察培養(yǎng)瓶孔中培養(yǎng)液量。用吸管分別吸出瓶中的細胞連同培養(yǎng)液，轉入15ml塑料離心管中。再用另一支吸管吸取PBS量約2ml，加入培養(yǎng)瓶中，輕輕吹打瓶壁，吸出轉入離心管中，大約總量為10ml左右。#p#分頁標題#e##p#分頁標題#e#
1.5.離心，設置離心機1000轉/分，1-2分鐘，沉淀即可。
1.6.取出離心管，輕輕吸出上清，倒入廢液缸。吸取培養(yǎng)液約7ML放入離心管，輕輕吹打細胞，使之均勻懸浮。
1.7.吸取0.5-1ML細胞懸液轉入EP管中，備計數(shù)用（10ul加計數(shù)板）。
1.8.吸取1ML配制好的凍存液加入離心管，與細胞混勻后，轉入凍存管（每小組做1管）。
1.9.標注：  標明細胞種類、凍存日期，凍存人。
1.10在4℃冰箱中放置 30 分鐘；然后轉入-20℃，放置30 分鐘；然后再轉入-80℃放置16－18 小時（或過夜）；**后放入液氮中長期保存。有條件的地方，可用凍存盒。
1.11注意事項：
（1）凍存過程需緩慢
（2）凍存細胞必須處在對數(shù)生長期，活力大于90％，無微生物污染。
（3）細胞濃度控制在：1×10⁷－5×10⁷/ml。
（4）使用合適的細胞冷凍保護劑，以保護細胞在冷凍過程中免受冰晶破壞。目前，**常用的冷凍保護劑是DMSO(二甲基亞砜)，使用終濃度為5－10％。但是，有些細胞系不能用DMSO作為冷凍保護劑，如人白血病細胞系HL-60。因為，DMSO 能誘導HL-60 細胞分化。在這種情況下，可選用其它冷凍保護劑，如甘油（glycele）,羥乙基淀粉等。
（5）DMSO 稀釋時會釋放大量熱量。因此，DMSO 不能直接加到細胞液中，必須事先配制。
 
 
2.哺乳動物細胞復蘇
2.1.準備工作
① 37℃水浴（保溫杯類物品）
②準備一個內裝5-10 ml 細胞完全培養(yǎng)液15ml離心管
③六孔板一塊（四小組可共用）
2.2.細胞復蘇操作
①帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，迅速放入37℃水浴中，手持凍存管不斷搖動。觀察完全解凍后移入超凈臺。冷凍管在水浴中解凍時，液面不可超過凍存管蓋面，否則，易發(fā)生污染。
②打開凍存管，迅速將細胞懸液吸到離心管中，輕輕混勻。
③1000rpm離心數(shù)分鐘，棄去上清液。
④沉淀中加入適當培養(yǎng)基，放入六孔板中37℃常規(guī)培養(yǎng)。
⑤第二天觀察生長情況。
2.3.注意事項：
①解凍操作過程動作要輕。由于冷凍保存過的細胞變得非常脆弱，不僅解凍速度要快，而且動作要輕。
②解凍時務必注意安全，預防冷凍管爆裂。，要帶手套，用鑷子將細胞冷凍管從液氮中取出，切不可直接用手，以免凍傷。